PCR-heterodúplex por agrupamiento: Implementación de un método de identificación de portadores de la mutación más común causal de fibrosis quística (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras empleadas. El estudio se
presentó al Comité de Ética de la Facultad
de Medicina de la
Universidad del
Rosario para su aprobación. Se utilizó una
colección de 400 muestras de sangre, tomadas
del banco del
laboratorio de
biología
celular y molecular, de personas sanas que antes firmaron un
consentimiento informado aceptando participar anónimamente
en estudios poblacionales; las muestras se habían
conservado en papel filtro S&S903. Se incluyeron como
controles muestras de 68 pacientes heterocigotos para la
mutación F508del, provenientes del Banco de ADN de fibrosis
quística y además muestras de 50 personas
voluntarias, homocigotas para el alelo normal, estos genotipos se
verificaron previamente con el estuche comercial de
detección de mutaciones de Roche Molecular Systems21 y la
técnica PCR-heterodúplex simple descrita por Raskin
et al. (13); esta última prueba se considera como el
«método de
referencia» para identificar la mutación F508del en
el presente estudio.

Técnica PCR-heterodúplex por
agrupamiento. En cada papel de filtro se ubicaron más
o menos 15 ml de sangre total (1 gota depositada directamente de
la jeringa), volumen que
permitía una saturación completa del papel, se
secaron y almacenaron a temperatura
ambiente. De
cada muestra se
extrajo un fragmento de 1 mm2, que se identificaron y agruparon en
conjuntos de
5, 10 ó 20 muestras. En seguida se realizó una
amplificación del ADN mediante la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR de la sigla en
inglés), y se agregó a cada grupo de
muestras una mezcla maestra que contenía: amortiguador 10X
(Tris Base 10 mM pH 8.0 y KCl
50 mM), MgCl2 2.5 mM, Chelex 100X al 0.09%, dNTPs 0.07mM, 0.6
pmol/µl de cada uno de los primers, para un volumen final
de 50 µl. Los primers utilizados fueron: -forward- 5’
GTT TTC CTG GAT TAT GCC TGG 3’ y -reverse-: 5’ ATG
CTT TGA TGA CGC TTC TGT 3’1. Al comienzo de la
reacción de PCR se hizo un choque térmico, pues se
sometieron las muestras a tres ciclos de desnaturalización
inicial (94°C por 6 minutos, luego desnaturalización a
96°C por 3 minutos y por último 3 minutos de
renaturalización a 55°C), estos ciclos se utilizan
para producir liberación del ADN e inactivar proteínas
y metales
pesados según la técnica descrita por Raskin et al.
(13), y Makowski et al. (14) Después, se agregó una
unidad de enzima TaqDNA polimerasa y se utilizó un
programa de
amplificación compuesto por desnaturalización
prolongada a 94°C por 5 minutos, seguida por 40 ciclos de
desnaturalización a 94°C por 45 segundos, alineamiento
a 60°C por 45 segundos y extensión a 72°C por 45
seg y se culminó con un período de extensión
prolongada de 72°C por 10 minutos.

Para el análisis de los productos
amplificados por PCR se requiere la formación de un
heterodúplex (híbrido de ADN que contenga una copia
normal y una mutante en una doble hebra in vitro). El
heterodúplex se obtuvo al desnaturalizar las cadenas
amplificadas de ADN a 94°C por 10 minutos y luego una fase de
renaturalización a 55°C por 25 minutos en las mezclas de
muestras amplificadas. Posteriormente, las muestras se separaron
con electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, durante 90
minutos a 120 voltios. Para cada corrido se incluyó un
control positivo
que correspondía a un paciente homocigoto para la
mutación F508del, un control negativo homocigoto para el
alelo normal y un blanco de reactivos. Los geles se visualizaron
bajo luz ultravioleta
teñidos con bromuro de etidio y los resultados se
documentaron mediante fotografía
en medio digital.

Determinación de la sensibilidad de la
técnica. Se hicieron agrupamientos aleatorios de 5, 10
y 20 muestras de sangre obtenida en papel de filtro S&S903 de
controles homocigotos para el alelo normal. A cada agrupamiento
se le adicionó un control heterocigoto para la
mutación F508del.

Además de identificar el número
mínimo óptimo de muestras en un agrupamiento que
permitiera identificar la presencia de un solo cromosoma portador
de la mutación, se analizó la sensibilidad de la
técnica mediante la relación S=a/(a+b), donde a son
los verdaderos positivos y b son los falsos negativos
(15).

La sensibilidad obtenida se comparó con la
determinada en la técnica PCR-heterodúplex simple
descrita por Raskin et al. (13)

Determinación de la especificidad de la
técnica. La especificidad se evaluó mediante la
identificación de resultados falsos positivos, en diez
agrupamientos compuestos por muestras de los controles sanos,
negativos para la mutación F508del. Los resultados
obtenidos se compararon con la especificidad determinada para la
PCR heterodúplex sin agrupamientos.

Determinación de la reproducibilidad de la
técnica. Un agrupamiento compuesto por 10 muestras de
controles homocigotos para el alelo normal más un
heterocigoto para la mutación F508del, se evaluó
bajo las mismas condiciones de PCR-heterodúplex por
agrupamiento en 10 ensayos
independientes.

Comparación de los métodos. Una vez estandarizada la
técnica, se tipificaron 400 muestras de sangre en papel de
filtro organizadas en 40 agrupamientos (de 10 muestras cada uno)
y se procedió a su análisis mediante
PCR-heterodúplex por agrupamiento, además, estas
400 muestras habrían sido previamente tipificadas como
homocigotas para el alelo normal, en forma individual con la
técnica de PCR-heterodúplex simple descrita por
Raskin et al. (13)

En cada uno de los ensayos se incluyó un control
heterocigoto para la mutación y los hallazgos de los
ensayos de agrupamiento se compararon con la técnica
PCR-heterodúplex simple.

RESULTADOS

La estrategia para
identificar a los portadores de la mutación F508del en un
programa masivo de filtrado, se basa en la formación de
heterodúplex en los agrupamientos de muestras que
contienen por lo menos un cromosoma mutante. Durante la
reacción de denaturación y renaturación de
estos grupos, se forman
dos tipos de moléculas, los homodúplex y los
heterodúplex. Los homodúplex corresponden a la
hibridación de dos cadenas normales o de dos cadenas
mutadas, mientras que los heterodúplex se forman por la
hibridación estocástica de una cadena de ADN normal
y una cadena mutada, que lleva a la formación de un bucle
en una de las cadenas, cuya movilidad electroforética es
diferente a la de los homodúplex (16,17).

Determinación de la sensibilidad de la PCR
heterodúplex por agrupamiento. El análisis de los
geles de poliacrilamida para los agrupamientos de 5 y 10 muestras
demostró la presencia de las bandas correspondientes al
alelo normal (92pb), al alelo mutante (89pb) y a los
heterodúplex. En el agrupamiento de 20 muestras no fue
posible descubrir la muestra heterocigota (Figura 1), lo que
permitió establecer el límite de sensibilidad de la
técnica en máximo 10 muestras (20 cromosomas). Se
observó una mayor intensidad de la banda correspondiente
al alelo normal con respecto a las otras, lo que es consecuencia
de la mayor concentración de ADN del alelo normal (10
ó 20 cromosomas) con respecto al mutado (1
cromosoma).

De 40 agrupamientos (de 9 muestras homocigotas para el
alelo normal más una muestra de un control heterocigoto
para la mutación F508del), no se detectó el
cromosoma mutado en tres. Estos resultados permiten estimar que
la sensibilidad de la técnica fue 92.5%. Para la
PCR-heterodúplex simple se determinó una ausencia
total de falsos negativos, e indicó una sensibilidad de
100%. Con el programa Epi-Info 6 se determinó un valor
predictivo positivo de 100% y un valor predictivo negativo de
92%.

Determinación de la especificidad de la
técnica. En el análisis de 10 agrupamientos de
personas con genotipo normal mediante PCR heterodúplex por
agrupamiento no se encontró ningún resultado falso
positivo, pues se obtuvo en todos los agrupamientos una
única banda correspondiente al alelo normal de 92pb. Esto
permite determinar que esta técnica tiene una
especificidad de 100%, si se tiene en cuenta que los primers o
cebadores sólo amplificaron el segmento de interés.

Determinación de la reproducibilidad de la
técnica. Este parámetro se evaluó
mediante repeticiones de montajes de PCR seguidos de la
formación de heterodúplex empleando agrupamientos
de muestras idénticas. El análisis fue realizado 10
veces independientes, y se obtuvieron los mismos resultados en
cada proceso, luego
se utilizó la prueba de concordancia Kappa no ponderada, y
se alcanzó un valor de concordancia de 100%, Kappa de 1 y
un valor p<0.000001 (Cuadro 1).

Comparación de los métodos.
En las 400 muestras analizadas se compararon los resultados
obtenidos mediante la técnica PCR-heterodúplex por
agrupamiento y otros métodos ya validados como
PCR-heterodúplex simple e hibridización con sondas
alelo específicas (ASO) para la identificación de
la mutación F508del. Se procedió al análisis
estadístico mediante una prueba de concordancia Kappa no
ponderada, con valores de
concordancia entre 99.2% y 100%, respectivamente, con un valor
p<0.00001 en ambas comparaciones (Cuadro 2).

DISCUSIÓN

La FQ es una enfermedad autosómica recesiva letal que afecta gran
cantidad de poblaciones alrededor del mundo. En Colombia no se
conoce su frecuencia real, ni la de los portadores de la
mutación F508del, que es la más frecuentemente
asociada con esta entidad. Un par de estudios preliminares
informaron una frecuencia de portadores cercana a 1 en 65
(11,12), valor que justifica la necesidad de emprender estudios
en un mayor número de personas en diversas regiones del
país para lograr así dar conclusiones precisas
sobre esta frecuencia e incluso obtener cálculos del
número probable de nuevos casos de afectados con la
enfermedad.

El análisis molecular de la F508del se ha visto
como un método diagnóstico de portadores y afectados en
varias poblaciones del mundo para descubrir en el primer caso,
las parejas en riesgo de tener
hijos afectados, ofrecer adecuados asesoramientos
genéticos y en el segundo caso conseguir un
diagnóstico temprano que permita establecer medidas que
mejoren la calidad y el
pronóstico de vida de los afectados.

Por lo general, los estudios moleculares se han hecho a
través de PCR seguida de análisis
electroforético, que permite identificar portadores
gracias a la visualización de las bandas de
amplificación del alelo normal y el mutado, que muestran 3
bases de diferencia, y de la banda del heterodúplex, que
migra más lentamente. Dada la cercanía de la
mutación I507del al sitio de la mutación F508del,
no es posible mediante PCR diferenciar homocigotos para una u
otra mutación, lo que podría llevar a errores de
genotipificación molecular. En el presente trabajo, se
efectuó un análisis de heterodúplex
posterior a la PCR, mediante desnaturalización de los
productos amplificados obtenidos, que permite diferenciar las
personas hetero y homocigotas para estas dos mutaciones, debido a
la formación de bandas de migración
lenta, producto de
interacciones no covalentes entre fragmentos distintos de ADN,
con cambios en su conformación que resultan de la
complementariedad incompleta de las hebras no idénticas.
Esta metodología, tiene también ventajas
sobre otras, como la PCR alelo especifica, pues en esta
última se usa mayor cantidad de primers (tres en total,
para identificar el alelo normal y el mutado) y requiere de
montaje de tubos de PCR que por separado identifiquen el alelo
normal y el mutado, además, se correría el riesgo
similar al uso de PCR de no diferenciar las mutaciones F508del e
I507del.

Si se tienen en cuenta las consideraciones de la
aplicación masiva de análisis moleculares para
identificar mutaciones como la F508del, es importante buscar
alternativas que permitan disminuir costos en los
procesos
manteniendo estándares de calidad adecuados en
términos de sensibilidad y especificidad. El uso de
agrupamientos de muestras, permite en un solo paso analizar
varias personas en búsqueda de los portadores, y aun de
los afectados, disminuye hasta en 80% la cantidad de reactivos
necesarios para la amplificación y en 90% el costo de los
procesos de post-PCR. De igual forma, el tiempo
necesario para el procesamiento de las muestras en una forma
masiva es considerablemente inferior, porque para procesar 1000
muestras por métodos convencionales se necesitarían
3 meses aproximadamente, mientras que por la técnica
PCR-heterodúplex por agrupamiento todo el proceso
tardaría alrededor de 5 días.

Para evitar los pasos de la extracción del ADN
convencional que aumentan los costos y el tiempo de
procesamiento, se ejecutó la técnica de
liberación de ADN basada en calor y el
empleo de
reactivos como el Chelex, al que se le ha atribuido una gran
capacidad quelante para extraer ácido nucleico; aun
así la sensibilidad que se informa en este estudio fue
92.5%, ya que en tres de 40 agrupamientos (que corresponden al
análisis de 400 muestras) a los que se había
introducido un heterocigoto tipificado antes molecularmente, no
se detectó el cromosoma mutado; esto pudo ser el reflejo
de una inadecuada liberación de ADN o de la presencia de
impurezas en la muestra analizada, principalmente hemoglobina,
compuesto que se ha asociado como un inhibidor de procesos de
amplificación; este riesgo, es inherente a la
metodología propuesta, pues al no usar técnicas
de extracción convencionales de ADN, la calidad y cantidad
de ADN liberado se afecta. Una posible solución a esta
limitante, que podría disminuir los inhibidores es el uso
de limpiezas previas al paso de liberación de ADN por
calor y chelex, mediante el uso de detergentes como el dodecil
sulfato de sodio (SDS), cuya función se
ha asociado con el rompimiento de bicapas lipídicas de las
membranas y con la unión a las cargas positivas de las
proteínas cromosómicas liberando el ADN a la
solución acuosa.

Mediante la técnica de PCR-heterodúplex
por agrupamientos, se obtuvieron bandas de amplificación
específicas para la mutación F508del en el
exón 10 del gen CFTR, lo que se evidenció mediante
electroforesis, por la visualización de bandas de peso
molecular acorde con lo esperado; este hallazgo permite atribuir
a la metodología una especificidad total, que
evitaría falsos positivos. El análisis posterior
con heterodúplex, obvia el riesgo metodológico
más grande que se tiene, por la cercanía de la
mutación I507del.

La realización de PCR «in situ», y
como no se efectuó un protocolo
convencional de extracción de ADN, demostró una
excelente reproducibilidad, pues al analizar diferentes
sacabocados de 1 mm de las mismas muestras en 10 ensayos
distintos, se obtuvieron los mismos resultados, lo que indica
que, bajo análisis estandarizados, la liberación de
ADN y la eficacia de
amplificación se mantienen constantes; este punto es de
gran importancia porque en análisis masivos, es
indispensable mantener valores de sensibilidad y especificidad
que repercutan en un óptimo costo-beneficio de la prueba
en la identificación de portadores de esta enfermedad
genética.

En relación con el futuro, la puesta en marcha de
esta metodología, permitirá llevar a cabo estudios
masivos en búsqueda de los portadores de la
mutación F508del en las diferentes regiones del
país, con el fin de conocer en cuáles zonas se
presenta un mayor número de portadores de esta
mutación y por ende un mayor riesgo de nuevos casos de
afectados con fibrosis quística. Así podría
incluso justificarse la ejecución de un filtrado
genético neonatal en recién nacidos, más
aún si se tiene en cuenta que está plenamente
confirmado que el costo para la identificación de
portadores y afectados es menor que los costos del tratamiento de
la enfermedad (19).

Con este objetivo, esta
estrategia molecular, representa un complemento a la medición de tripsina inmuno-reactiva, que
no permite identificar portadores sanos y además genera
muchos falsos positivos que van en contravención del costo
beneficio necesario en un programa de filtrado (20). Sin embargo,
se debe tener en cuenta que aunque la mutación F508del es
la más frecuente en Colombia, estos programas de
filtrado neonatal se deberían complementar con el estudio
de mutaciones adicionales seleccionadas según las
frecuencias mutacionales informadas para cada una de las regiones
del país (12).

La realización de la PCR-heterodúplex por
agrupamiento a partir de manchas de sangre en papel filtro, el
mismo que se utiliza en los programas de filtrado neonatal para
hipotiroidismo congénito, facilita la ejecución de
esta prueba para identificar portadores y afectados por la
mutación F508del. En este trabajo se demuestra que por la
alta sensibilidad, reproducibilidad y especificidad de la
técnica empleada, se convierte en una herramienta adecuada
que cumple con los criterios técnicos que se deben
considerar en su aplicación como método de
filtrado. La correlación obtenida entre los resultados que
se alcanzaron con esta técnica y las metodologías
ya validadas, hace que esta prueba sea confiable, con un
porcentaje de falsos positivos y negativos muy bajo, lo que
garantiza así que no se presenten errores de
diagnóstico.

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Lina Manuela Jay, Lic.
Quim.1,
Heidi Mateus, M.D.2, Dora Fonseca,
Biol.2, Carlos
Martín Restrepo, M.D.3, Genoveva Keyeux, Biol.,
Ph.D.4
1.
Licenciada en Química, Universidad
Distrital Francisco José de Caldas, Facultad de Ciencias y
Educación,
Bogotá, Colombia.
2. Profesora Titular, Unidad de Genética, Facultad de
Medicina, Universidad del Rosario, Bogotá, Colombia.
3. Coordinador Unidad de Genética, Facultad de Medicina,
Universidad del Rosario, Bogotá, Colombia.
4. Profesora Asociada, Unidad de Genética, Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá.